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近日，清華大學(xué)精密儀器系尤政教授團(tuán)隊(duì)提出了基于點(diǎn)陣激光激發(fā)方法的高通量流式成像方法。該方法可實(shí)現(xiàn)低成本、高可擴(kuò)展性的成像流式細(xì)胞儀，而且首次驗(yàn)證了全光譜成像流式技術(shù)。相關(guān)成果以“Imaging flow cytometry using linear array spot excitation”為題在期刊《Device》上發(fā)表，并被選為當(dāng)期封面文章。

研究背景與成果

流式和顯微鏡是細(xì)胞檢測的兩個(gè)基本工具。流式技術(shù)具有高通量和豐富的分子檢測信息，但缺乏細(xì)胞形態(tài)信息；相反，熒光顯微鏡可以提供細(xì)胞影像信息，但檢測通量低，難以獲取足夠的樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。自流式細(xì)胞儀問世以來，其發(fā)展趨勢一直在于保持高檢測通量的同時(shí)增加更多信息維度，例如空間形態(tài)信息或光譜信息，以實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的細(xì)胞分析或分選。成像流式技術(shù)是一種整合了流式細(xì)胞儀高檢測通量和熒光顯微鏡空間分辨能力的儀器。然而，由于成像通量、分辨率和檢測靈敏度之間的基本矛盾，現(xiàn)有的成像流式技術(shù)通常采用復(fù)雜的光路系統(tǒng)、復(fù)雜的圖像重構(gòu)算法，同時(shí)成像可擴(kuò)展性也很有限。這使得成像流式細(xì)胞儀難以達(dá)到像傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀那樣的高檢測通道數(shù)，并且其高昂的技術(shù)成本限制了應(yīng)用范圍。

為解決這些問題，清華大學(xué)精儀系尤政教授課題組提出了一種基于點(diǎn)陣激光激發(fā)的成像方法，即Linear spot array excitation（LASE）。該方法的核心思想是使用點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)光斑替代傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀中的橢圓或條狀光斑，從而賦予流式細(xì)胞儀成像能力。

圖1：點(diǎn)陣激光激發(fā)成像原理示意圖

圖1展示了該成像方法的工作原理。在檢測區(qū)域中，激發(fā)光斑呈一串等間隔的點(diǎn)陣光斑，由衍射光學(xué)器件生成，光斑間隔大于細(xì)胞大小，并且其排列直線與細(xì)胞運(yùn)動直線呈一定的小角度。當(dāng)細(xì)胞依次通過照明光斑時(shí)，將產(chǎn)生一串熒光和散射光信號。在圖像重構(gòu)階段，只需通過信號的分割和重組即可重建細(xì)胞圖像。該方法具有實(shí)現(xiàn)簡單、實(shí)時(shí)重建的優(yōu)勢，并且與現(xiàn)有流式細(xì)胞儀光路結(jié)構(gòu)兼容，因此具有良好的可擴(kuò)展性，能夠在高檢測通量的基礎(chǔ)上，同時(shí)實(shí)現(xiàn)多激光、多熒光通道以及無標(biāo)記成像。

技術(shù)成果展示

圖2. 雙激光五通道成像流式系統(tǒng)

圖3.細(xì)胞器進(jìn)行成像與細(xì)胞周期研究

本研究利用基于LASE成像方法構(gòu)建了一個(gè)成像系統(tǒng)，具備2色激光（488nm/638nm）和5個(gè)成像通道（明場、FITC、PE、PI、APC），如圖2A所示。該系統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)證在30×30μm的成像視場下，具有1.3μm的空間分辨率。當(dāng)細(xì)胞樣本以5m/s的流速經(jīng)過探測區(qū)域后，系統(tǒng)能夠進(jìn)行無標(biāo)記的明場成像和熒光成像，且不會出現(xiàn)運(yùn)動模糊，成像通量最高可達(dá)每秒5000個(gè)細(xì)胞每秒。該系統(tǒng)不僅能夠?qū)?xì)胞中的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像（見圖3A），而且可以在多個(gè)熒光波段下，實(shí)現(xiàn)對不同細(xì)胞結(jié)構(gòu)的同時(shí)成像（見圖3B）。在生物學(xué)應(yīng)用中，圖像被廣泛視為金標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)樗軌驗(yàn)榧?xì)胞分析提供更為豐富和準(zhǔn)確的信息，從而更細(xì)致準(zhǔn)確地進(jìn)行細(xì)胞分型。舉例來說，通過圖像，可以在傳統(tǒng)流式基礎(chǔ)上更進(jìn)一步區(qū)分細(xì)胞周期M期的細(xì)胞核形態(tài)，如圖3C所示。

圖4. 32通道全光譜成像流式驗(yàn)證

得益于LASE成像方法的高度可擴(kuò)展性，本論文將成像熒光信號引入一個(gè)基于棱鏡色散的32通道光譜儀中，初步驗(yàn)證了全光譜成像流式細(xì)胞儀的可行性。該系統(tǒng)在保持每秒5000個(gè)細(xì)胞的檢測速度通量的同時(shí)，能夠同時(shí)在32個(gè)光譜通道上對細(xì)胞進(jìn)行成像。借助光譜分解算法，可以有效解決多染料檢測實(shí)驗(yàn)中染料光譜混疊效應(yīng)的問題，將成像流式細(xì)胞儀的理論可檢測染料數(shù)擴(kuò)展至30以上的量級。這將大大提高成像流式細(xì)胞儀給單細(xì)胞分析帶來的信息量。

成果優(yōu)勢

該研究提出的點(diǎn)陣激光激發(fā)的成像方法，具有以下優(yōu)勢：